передплата Українською | In English

№24, грудень 2014

Наноскоп - провісник революції в біології та медицині

Поділитися:

Королівська шведська академія присудила Нобелівську премію з хімії 2014 року Еріку Бетцігу, Стефану Хеллу та Вільяму Мьорнеру за розвиток флуоресцентної мікроскопії суперроздільної здатності. Найвищої наукової відзнаки за досягнення у галузі хімії удостоєні двоє фізиків та фахівець у галузі фізичної хімії. Завдяки їхнім зусиллям оптичний мікроскоп, який вірою і правдою служить науці вже понад чотириста років, здобув право називатися наноскопом: він дав можливість спостерігати й вивчати об’єкти розмірами всього десятки нанометрів (нм), що на порядок менше за довжину хвилі світла. І вже невдовзі після створення цього приладу одержані з його допомогою нові результати у клітинній біології, мікробіології, нейробіології свідчать, що ми на порозі революції в біології та медицині.

Проривне значення робіт нобеліантів полягає передовсім у тому, що їхні автори подолали фундаментальне обмеження на величину роздільної здатності оптичного мікроскопа, сформульоване наприкінці ХІХ століття Ернстом Аббе та лордом Релеєм. Це обмеження доводило неможливість розрізнити два елементи структури спостережуваного об’єкта за допомогою оптичного мікроскопа, якщо вони розташовані на відстані, меншій за половину довжини хвилі світла в поперечній площині, й навіть на ще більшій відстані в поздовжньому напрямі. Це обмеження зумовлене дифракцією світлової хвилі й має загальний характер, тобто є чинним для будь­яких приладів, у яких для формування зображення використовуються хвилі тої чи іншої природи. Так, роздільна здатність електрон­них мікроскопів також визначається цим критерієм, тільки довжина хвилі де­Бройля для електронів набагато менша за довжину хвилі світла, що й зумовлює значно вищу роздільну здатність електронної мікроскопії (на жаль, цей метод дуже складно застосувати для живих клітин). В оптичному мікроскопі зображення формується світлом видимого діапазону, з дов­жинами хвиль від 400 нм (далекий синій край спектра) до 700 нм (далекий червоний край). Відповідно, найменші деталі зображення, які можна розрізнити за допомогою оптичного мікроскопа, мають розміри від 200 нм у разі спостереження у фіолетових променях і до 350 нм у червоній ділянці спектра. Нагадаємо, що, наприклад, розміри бактерії кишкової палички E. Coli становлять приблизно 1000 нм. Це означає, що бачити таку бактерію в оптичний мік­роскоп ще можна, а от уже вивчати деталі внутрішньої будови цієї, а також інших живих бактерій чи клітин неабияк складно.

Обмеження роздільної здатності, визначене Аббе, стосується предмета, який спостерігається при його освітленні зовнішнім джерелом. Можливо, це обмеження не поширюється на об’єкти, що світяться самі? Ні, і для таких предметів, як довів ще у 1911 році Леонід Мандельштам, згодом відомий радянський учений, академік АН СРСР, дифракційне обмеження роздільної здатності залишається слушним. Більше того, навіть коли джерело світла є, по суті, світловою точкою з розмірами в сотні й тисячі разів меншими за дов­жину хвилі світла, все одно замість неї ми бачитимемо в оптичний мі­к­­ро­скоп світлову пляму розмірами порядку довжини хвилі світла. Тож розрізнити дві точки, якщо вони розташовані на відстані, меншій за дов­жину хвилі, знову не вдасться. Здавалося б, природа встановила тут непереборну перешкоду. І все ж застосування нобеліантами саме таких надмалих випромінювачів світла забезпечило прорив до якісно нового рубежу оптичної мікроскопії.

Доречно поставити запитання: а якого ж розміру може бути найменше джерело світла? Відповідь очевидна: найменшою часткою речовини є молекула. Якщо молекула випромінює світло, наприклад унаслідок флуоресценції, це й буде найменшим джерелом світла. І такі молекули­світляки нині широко застосовуються в мікроскопії.

Флуоресцентна мікроскопія має справу з об’єктами, які або спеціально забарвлені відповідними барвниками, або самі здатні випромінювати світло в разі їх збудження зовнішнім джерелом. Дуже важливим для дослідження біологічних структур методами флуоресцентної мікроскопії було відкриття так званого зеленого флуоресцентного білка, котрий без додавання барвників світиться зеленим світлом під впливом синього або ультрафіолетового випромінювання (Нобелівська премія з хімії 2008 року). Застосовуючи методи флуоресцентної мікроскопії, вивчають біологічні структури в наукових лабораторіях усього світу, зокрема й в Україні. Відомим фахівцем, автором численних робіт, кількох монографій з флуоресцентної мікроскопії, розробником нових флуоресцентних сенсорів і зондів є Олександр Демченко з Інституту біохімії
імені О. В. Палладіна НАН України. Ефективні органічні барвники для флуоресцентної мікроскопії розробляють та досліджують в Інституті органічної хімії НАН України, зокрема у відділі під керівництвом Олександра Іщенка.

Треба зауважити, що раніше при застосуванні всіх методів флуоресцентної спектроскопії сигнал формувався завдяки флуоресценції досить великих ансамблів молекул. А, як уже зазначалося, найменше джерело світла складається лише з однієї молекули, детектування сигналу флуоресценції котрої в рідині чи твердому тілі на фоні мільярдів чи трильйонів молекул розчинника або твердотільної матриці є дуже складним завданням, з яким уперше впорався один із лауреатів – Вільям Мьорнер на початку 90­х років минулого століття.

Щоб уявити складність цього зав­дання, нагадаємо, що йдеться про чутливість на рівні 1,66 х 10­24 моля. Потужність світла, яке випромінюється однією молекулою, сягає лише
3 х (10­11 / 10­13) Вт. Якби ми спробували розгледіти лампочку потужністю 100 Вт неозброєним оком на відстані 100 кілометрів, то енергія, котра потраплятиме на сітківку нашого ока протягом секунди, якраз дорівнюватиме енергії випромінювання однієї молекули за такий само час. Щоб гарантовано збуджувати лазером тільки одну молекулу барвника, треба, щоб на об’єм, куди фокусується випромінювання лазера і який містить близько ста мільярдів молекул розчинника, припадало б не більше одної молекули барвника. Аби зрозуміти, наскільки складно виокремити молекулу барвника на фоні ста міль­ярдів молекул розчинника, уявімо велике пшеничне поле завширшки 10 і завдовжки 20 кілометрів. На ньому якраз і росте в середньому сто мільярдів колосків. Якби нас попросили відшукати з­поміж них якийсь один особливий, то це було б складніше, ніж знайти голку в копиці сіна! Якщо до цього додати ще низку чинників, які значно зменшують корисний сигнал, то стає зрозумілим, чому детектування флуоресценції окремих молекул тривалий час залишалося вкрай складною експериментальною проблемою, котру, попри все, успішно розв’язали у 1990­х роках.

Відтоді техніку детектування окремих молекул значно вдосконалили, й сьогодні флуоресценція одиночних молекул лежить в основі одного з двох підходів, які реалізують флуоресцентну мікроскопію з розділенням, що перевищує знамените обмеження Аббе. Цей підхід, розвинутий Еріком Бетцігом та Віль­ямом Мьорнером, можна охарактеризувати як «мікроскопію суперрозділення з одиничним флуорофором*». У цьому методі зображення об’єкта із суперроздільною здатністю формується із допомогою зображень окремих флуорофорів, положення яких визначається на порядок точніше, ніж передбачено обмеженням Аббе.

Але, спитає читач, де ж суперрозділення? Якщо ми позначимо контури якогось предмета маленькими лампочками, розташованими одна від одної за один метр, то в темряві ніяк не розрізнимо менші деталі контуру, наприклад розміром один сантиметр, навіть якщо положення лампочки можемо визначити досить точно. Щоб це зробити, лампочки мають бути розташовані густіше! Але ж тоді треба згадати обмеження Аббе: якщо наші «лампочки» розташовані ближче, ніж довжина хвилі, ми вже їх не розрізнимо як окремі джерела. Виходить, замк­нене коло? Ні, вихід є, і його запропонував Ерік Бетціг: якщо робити окремі послідовні знімки поля зоб­раження так, що на кожному знімку ми реєструватимемо картину флуоресценції окремих молекул, розташованих одна від одної на відстані, більшій, ніж половина довжини хвилі світла, а на різних знімках фіксувати зображення різних груп молекул, то все буде якраз так, як нам треба. Адже положення кожної молекули, як зазначалося вище, визначається з субхвильовою точністю, а об’єднуючи зображення молекул з різних знімків у одній картині, можна відтворити деталі зображення об’єкта з такою самою точністю.

Перші пропозиції щодо використання точкових джерел різних спект­ральних класів Ерік Бетціг висловив у 1995 році, однак вони не стали тоді оптимальним утіленням ідеї суперрозділення. Два роки по тому група Вільяма Мьорнера провела експерименти з молекулами мутанта зеленого флуоресцентного білка, щоб дослідити їхню здатність випромінювати світло. У разі збудження окремих молекул синім світлом з довжиною хвилі 488 нм несподівано виявилося, що молекула «блимає»: флуоресценція кілька разів то припиняється, то відновлюється і, зрештою, гасне. Дуже цікавим ефектом стало те, що молекулу вдавалося знову активувати, відновивши її здатність до флуоресценції завдяки освітленню фіолетовим світлом з меншою (405 нм) довжиною хвилі. Це була перша експериментальна демонстрація оптичного керування флуоресценцією білка, його перемикання між активною і неактивною фазами.

У 2002 році американські вчені Патерсон (Patterson) та Ліпінкот­Шварц (Lippincott­Schwartz) повідомили про здатність зеленого флуоресцентного білка (який початково був нездатний до флуоресценції) після опромінення фіолетовим світлом світитися під дією синього світла. Було встановлено, що через де­який час після тривалого інтенсивного опромінення таким синім світлом молекула білка повністю втрачала здатність до флуоресценції внаслідок незворотних фотоперетворень.

Бетціг, дізнавшись про ці результати, зрозумів, що вони можуть бути ключем до розв’язання проблеми мік­роскопії суперроздільної здатності. Якщо неактивні молекули цього білка освітити слабким фіолетовим світлом, то деякі з них (не всі, тільки мала їх частка) набувають здатності до флуоресценції. Тоді їх можна локалізувати із суперроздільною точністю. Після освітлення протягом певного часу інтенсивним світлом відбувається фоторуйнування цих молекул. Далі можна «включити» наступний масив молекул­маркерів і повторювати процедуру визначення положення вже нового набору молекул доти, доки не набереться достатня кількість окремих знімків для відтворення деталей зображення із суперрозділенням. Пізніше, у 2006 році, Бетцігу у співпраці з іншими групами вдалося приєднати зелений флуоресцентний білок до трансмембранного білка лізосоми, що дало змогу одержати, зокрема, структуру тонких зрізів лізосом ссавців.

Стефана Хелла відзначено премією за принципово іншу реалізацію методу мікроскопії суперрозділення. Ще у 1997 році він сформулював нові принципи високороздільної мік­роскопії, яка ґрунтується на ефекті погашення флуоресценції шляхом вимушених переходів молекул зі збудженого в основний стан. Для реалізації методу Хелла застосовують два лазерні пучки. Молекула, поглинувши світлову енергію з одного пучка, переходить у збуджений стан і релаксує з випромінюванням фотона, що й реєструється фотоприймачем. Якщо молекулу, котра перебуває у збудженому стані, освітити досить інтенсивним світлом, то відбудеться її вимушений або стимульований перехід в основний стан. При цьому фотон, який поширюється в напрямку світла лазера, не реєструватиметься фотоприймачем. Так досягається гасіння сигналу флуоресценції.

Важливий елемент ідеї Хелла – використання лазерних пучків незвичайної конфігурації (іноді їх називають сингулярними оптичними пучками) для гасіння флуоресценції. Радіальний профіль інтенсивності світла такого пучка має нуль на осі пучка. Поперечний розподіл інтенсивності нагадує бублик з діркою в центрі. Образно кажучи, такі два лазерні пучки створюють світловий зонд субхвильового розміру, переміщаючи який по спостережуваному об’єкту, можна вивчати деталі його структури з суперрозділенням.

Як бачимо, для методу, запропонованого Хеллом, принциповим є використання ефектів стимульованого придушення флуоресценції з допомогою світлових пучків спеціальної форми. Варто зауважити, що ці дві його складові добре відомі українським фізикам, котрі одержали важливі й пріоритетні результати і з дослідження вимушених переходів у молекулах органічних барвників, і з фізики лазерних пучків із нульовою інтенсивністю на осі.

Так, стимульовані переходи в органічних молекулах вивчав у Інс­титуті фізики НАН України Є. Тихонов під керівництвом академіка
М. Шпака ще у 1960­х роках, коли створювалися перші лазери на органічних барвниках. Сьогодні ці роботи успішно розвиває Михайло Бондар, який, зокрема, недавно повідомив про перше спостереження двофотонного стимульованого погашення флуоресценції в молекулярних системах, що відкриває нові перспективи флуоресцентної мікроскопії.

Багато цікавого можна розповіс­ти й про лазерні пучки з нульовою інтенсивністю на осі. Вони відомі понад півстоліття, проте порівняно недавно інтерес до них надзвичайно збільшився. Виявилося, що вони несуть оптичні вихори, мають низку нових незвичайних властивостей, які описуються законами так званої сингулярної оптики. Це молода галузь оптики, й варто відзначити, що біля її витоків стояли й українські вчені, зокрема Марат Соскін, знаний у світі також своїми роботами з квантової електроніки та голографії. Він разом зі своїм учнем Михайлом Васнецовим запропонував нині широко впроваджений у світі метод генерації таких «сингулярних» лазерних пучків із допомогою спеціальних голограм, а також встановив важливі закономірності генерації, поширення та перетворення лазерних пучків з оптичними вихорами.

Повернімося до лауреатів. Кожен із них ішов до найвищого визнання своєю дорогою.

У списку першим за абеткою стоїть Ерік Бетціг (Eric Betzig), американський фізик, котрий народився 13 січня 1960 року в невеликому (трохи більше 100 тисяч жителів) місті Анн­Арбор (штат Мічиган). Навчався в Каліфорнійському технологічному інституті, який закінчив зі ступенем бакалавра з фізики у 1983 році. Продовжив навчання в Корнельському університеті, де здобув ступінь магістра (1985) і ступінь доктора філософії в галузі прикладної та інженерної фізики (1988).

Під час роботи над дисертацією, а потім працюючи протягом шести років у AT & T Белл лабораторії як фізик­експериментатор, він зробив вагомий внесок у розвиток мікрос­копії ближнього поля, забезпечивши її широке практичне застосування біологами. За свої роботи Бетціг двічі (у 1992 та 1993 рр.) удостоєний премії Національної академії наук США імені Вільяма Л. Макміллана.

На той час стало зрозуміло, що розроблені методи, які стали потужним інструментом вивчення мертвих клітин, не давали змоги досліджувати з таким же розділенням живі структури. У 1996 році Бетціг залишив дослідну роботу в галузі фізики й перейшов у промисловість, на посаду віце­президента з досліджень і розроблень у Ann Arbor Machine Company, що належала його батькові.

Через сім років він залишив роботу в компанії та повернувся до досліджень з мікроскопії. А у 2006 році став керівником групи в Медичному інституті Говарда Х’юза, дослідницького кампусу Жанелія (Janelia Farm Research Campus) неподалік від Вашингтона, щоб продовжувати працювати над розвитком методів флуоресцентної мікроскопії надвисокої роздільної здатності, де й виконав революційні роботи, про які йшлося.

Стефан Хелл (Stefan W. Hell), німецький фізик, директор Інституту біофізичної хімії товариства Макса Планка в Геттінгені (Німеччина), народився в сім’ї етнічних німців у містечку Арад на заході Румунії 23 грудня 1962 року. Батько Стефана був інженером, а мати вчителькою. У 1978 році сім’я емігрувала з Румунії до Західної Німеччини.

З 1981 року Хелл навчався в університеті Гейдельберга, де захистив дисертацію на тему «Зображення прозорих мікроструктур у конфокальному мікроскопі» й здобув ступінь доктора в 1990 році. Нетривалий період працював як незалежний винахідник, удосконалюючи техніку конфокальної мікрос­копії, що стала пізніше відома як 4пі­мікроскопія. Два роки (1991– 1993) працював у Європейській лабораторії молекулярної біології в Гейдельберзі. У
1993 році пере­йшов до Університету Турку (Фінляндія), де розробляв принципи STED­мікроскопії як керівник групи медичного факультету. З жовтня 2002 року очолює Інститут біофізичної хімії в Геттінгені та відділ нанобіофотоніки в цьому інституті. З 2003 року також керує департаментом у відділенні оптичної наноскопії Німецького науково­дослідного центру раку в Гейдельберзі та є професором університету цього міста.

Стефан Хелл – автор понад 200 наукових праць, лауреат численних нагород за наукову діяльність: премії Міжнародної комісії з оптики (2000), премії Гельмгольца з мет­рології (2001), дослідницької премії Карла Цейса (2002), Інноваційної премії німецького Федерального президента (2006), премії з прикладної фізики Юліуса Шпрінгера (2007), премії Гольфрида Вільгельма Лейбніца (2008), Державної премії Нижньої Саксонії (2008), премії з фізики Отто­Ганна (2009), премії сім’ї Хансен (2011) та Європейської премії наук фонду Кьорбера (2011).

Третій лауреат Вільям Мьорнер (William E. Moerner), американський фізичний хімік чи хімічний фізик, який нині працює як біо­фізик, народився 24 червня 1953 року на базі військово­повітряних сил у містечку Плезантон (штат Каліфорнія). Його життєвий шлях – це шлях типового відмінника, котрий здобув найвищий ранг для бойскаута – відзнаку скаута­орла. Навчаючись в університеті Вашингтона в Сент­Луїсі, був стипендіатом Александра С. Лангсдорфа для студентів із найвищим академічним потенціалом, а закінчивши університет у 1975 році, здобув одразу три дипломи бакалавра: з фізики, електротехніки та математики – й усі з відзнакою! Потім була аспірантура Корнельського університету та захисти магістерської (1978) і докторської дисертацій (1982). За час навчання студент­відмінник здобув нагороду декана «За винятково видатні академічні досягнення» та нагороду Етана Шеплі за «Видатні досягнення при закінченні коледжу».

З 1981 по 1995 рік працював у дослідницькому центрі IBM у Сан­Хосе (Каліфорнія) спочатку як штатний працівник, потім як менеджер і керівник проектів. Водночас був професором фізичної хімії в кількох наукових центрах, зокрема університету Гарварда. У 1998 році його наукова група перейшла до університету Стенфорда, де Мьорнер став професором хімії (1998), професором Гаррі Мошера (2003), професором (за згодою) прикладної фізики (2005). З 2011 по 2014 рік – завідувач кафедри хімії. На травень 2014 року Вільям Мьорнер – автор 386 публікацій, керівник 26 дисертацій, написаних студентами університету Стенфорда.

Лауреат численних нагород та відзнак. Серед них: Національний переможець премії видатному юному професіоналу 1984 року; Товариства електроінженерів Ета Каппа Ню (1985); премія за видатні технічні досягнення IBM (1988 та 1992); премія Американського фізичного товариства ім. Ерла Плієра (2001); премія Вульфа з хімії (2008); премія Ірвінга Ленгмюра з хімічної фізики Американського фізичного товариства (2009); премія Піттсбурга зі спектроскопії (2012); премія Петера Дебая з фізичної хімії Американського хімічного товариства (2013).

* * *

…Через два тижні після оголошення про присудження Нобелівської премії з хімії 2014 року науковий світ облетіло повідомлення про новий винахід Еріка Бетціга, котрий, на особисту думку автора, матиме набагато більше значення для науки, ніж попередні його розробки. У статті у відомому журналі Science повідомляється, що розроблений ним мікроскоп освітлює досліджуваний зразок збоку багатьма світловими променями, які не шкодять клітині, завдяки чому можна робити знімки одразу всієї освітлюваної мікроскопом картини. Робота вже дає свої плоди: вчені можуть спостерігати за процесами м’язових скорочень ембріона нематоди, метастази ракових клітин, взаємодії Т­лімфоцитів і організмами, що спричинюють інфекцію.

Науку чекають нові революційні відкриття!

 

_______________

*Флуорофором називають молекулу або частину молекули, здатну до флуоресценції. Флуорофор після поглинаня світла перевипромінює його на більших довжинах хвиль, і його можна застосовувати як мітки, приєднуючи їх, подібно фарам на авто, до клітин, біологічних молекул на кшталт таких собі світлових маркерів.

Автор: Анатолій НЕГРІЙКО

Коментарі

Заповніть поля відмічені червоним!

Додати коментар

Увійдіть в систему, використовуючи аккаунт соціальної мережі:
Коментар:

Поля відмічені *(зірочкою) обов'язкові для заповнення.

Плакат - брат барикад

Архів журналу Віче

Віче №15/2016 №15
Реклама в журналі Інформація авторам Передплата
Останні новини

Львів стане п'ятим українським містом, в якому запустять Glovo Вчора, 19 квітня

Порошенка і Зеленського просять публічно заявити про невідворотність курсу на ЄС і НАТО Вчора, 19 квітня

У Ахметова відреагували на рішення АМКУ про покупку заводу Абрамовича Вчора, 19 квітня

Посол ЄС шкодує через відсутність серйозних дебатів між кандидатами в президенти України Вчора, 19 квітня

Злочевський купує у британців українську газову компанію Вчора, 19 квітня

Коломойський розповів, як переховував у себе Ложкіна Вчора, 19 квітня

Вибори-2019: чи прилетить до Зеленського «чорний лебідь», який все зіпсує Вчора, 19 квітня

ЗМІ: По всій Україні проходять протести проти бездіяльності влади. ВІДЕО Вчора, 19 квітня

У НБУ обіцяють захистити права і заощадження клієнтів Приватбанку Вчора, 19 квітня

Політична проституція: верхи – Порошенку, а низи – Зеленському, - ЗМІ Вчора, 19 квітня